Morphology of the eyeball, orbit and retina of Atlantic salmon (Salmo salar) alevins under hypoxic conditions / Morfología del bulbo ocular, órbita y retina de alevines del salmón del Atlántico (Salmo salar) bajo condiciones hipóxicas

It has been demonstrated that hypoxia retards the growth of fish, reduces the survival of their larvae, deforms their vertebral column, but despite this teleost fish have the ability to completely regenerate many of their tissues, particularly the retina. As we do not have enough information about the effects of hypoxia on the eyeball, orbit and retina of Atlantic salmon (Salmo salar), we propose the following objectives: 1) Compare the morphological changes of the eyeball of fish subject to hypoxia and normoxia. 2) Determine changes in the orbit structure. 3) Describe the retina of salmon alevins. 4). Recognize hypoxic cells using the anti-Hif1a antibody in the retina of alevins as a sensor. 5) Determine the Shh morphogenic expression in alevins exposed to different times of hypoxia. Around 1,000 Salmo salar alevins were placed in a continuous water flow of 9 °C at 100 % SatO2 and alevins maintained at a hypoxia of 60 % SatO2. The latter were transferred to normoxia (at days two, four, and eight after hatching). A control group maintained at continuous normoxia and another at continuous hypoxia was also considered. All the alevins were euthanized at 950 UTAs (±2 months after hatching). Diaphonization (double-stain) according to the Hanken & Wassersug technique was undertaken to describe the morphology of the periocular cartilage and to measure the ocular diameter. The HIF-1a factor antibody 1:50, and the anti-Shh antibody dilution of 1:100 were used. The alevins after hatching had large eyeballs with the optic cup having an embryonic shape, even a choroidal fissure. The greatest thickness was observed in the nasal ventral zone which corresponds to a zone of pluripotent cells. The optic cup aspect with embryonic characteristics has only been reported in salmonids. The central retina of the alevins those were cultivated with a 60 % saturation of O2 for two, four or eight days had positive immunostaining when analyzed with the anti-HIF1a antibody hypoxia sensor. The inner ganglion and nuclear layers had immunopositive cells, with the highest in the alevins that were two days in hypoxia and the lowest when the hypoxia was chronic. Nevertheless, in the latter case the alevins had anatomical deformation of the eyeball and periocular cartilage. The anti-Shh antibody clearly shows a gradient that is expressed in the germinative zone and in the cells of the inner ganglion and nuclear layers. The eyeball and particularly the retina in salmon alevins are an example of neuronal plasticity and neurogenesis.

Se ha demostrado que la hipoxia retarda el crecimiento de los peces, reduce la supervivencia de sus larvas, deforma su columna vertebral, pero a pesar de esto, este pez teleósteo tiene la capacidad de regenerar completamente muchos de sus tejidos, en particular la retina. Como no existe suficiente información sobre los efectos de la hipoxia en el bulbo ocular, la órbita y retina del salmón del Atlántico (Salmo salar), los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar los cambios morfológicos del bulbo ocular del pescado sujetos a hipoxia y normoxia; 2) Determinar los cambios en la estructura de la órbita; 3) Describir la retina de los alevines de salmón; 4) Reconocer las células hipóxicas utilizando el anticuerpo anti-Hif1a en la retina de alevines como un sensor; 5) Determinar la expresión morfogenética de Shh en alevines expuestos a diferentes momentos de hipoxia. Alrededor de 1.000 alevines Salmo salar se colocaron en un flujo continuo de agua a 9 °C, con 100 % de SatO2 y otros alevines se mantuvieron con una hipoxia de 60 % SatO2. Estos últimos fueron trasladados a normoxia (en los días dos, cuatro y ocho después de la eclosión). Un grupo control se mantuvo a normoxia continua y otro grupo a hipoxia continua. Todos los alevines se sacrificaron a 950 UTA (+ dos meses después de la eclosión). Se realizcón una diafonización (doble tinción), de acuerdo con la técnica de Hanken & Wassersug, para describir la morfología del cartílago periocular y para medir el diámetro ocular. Se utilizaron el anticuerpo anti-Hif1a a una dilución 1:50, y el anticuerpo anti-Shh a una dilución de 1:100. Los alevines después de la eclosión presentaron grandes bulbos oculares, con la copa óptica con forma embrionaria, incluso una fisura coroidea. El mayor espesor se observó en la zona ventral nasal que corresponde a una zona de células pluripotentes. El aspecto de la copa óptica con características embrionarias sólo se ha informado en los salmónidos. La retina central de los alevines fueron cultivadas con una saturación de 60 % de O2 para dos, cuatro y ocho días, y presentó inmunotinción positiva cuando se analizó con el sensor de hipoxia, el anticuerpo anti-HIF1a. El ganglio interior y las capas nucleares presentaron células immunopositivas, con los niveles más altos en los alevines con dos días de hipoxia y niveles más bajos en hipoxia crónica. Sin embargo, en éste último caso los alevines presentaron una deformación anatómica del bulbo ocular y el cartílago periocular. El anticuerpo anti-Shh mostró claramente un gradiente expresado en la zona germinativa y en las células del ganglio interior y las capas nucleares. El bulbo ocular y en particular la retina en alevines de salmón son un ejemplo de plasticidad neuronal y neurogénesis.

Desarrollo de la aleta caudal del salmón (Salmo salar) / Salmon caudal fin development (Salmo salar)

Las patologías y traumas de la aleta caudal afectan la natación, dificultan la alimentación y la eficiencia de escape de los peces, además aumentan la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y fúngicas. Los salmones adultos pueden regenerar rápida y completamente su aleta si esta es amputada. Sin embargo, se han reportado en el sur de Chile, alevines que expresan defectos anatómicos en la aleta caudal asociados a un alto índice de mortalidad donde no ocurre regeneración. Existen múltiples estudios sobre la aleta caudal de peces adultos pero esta descripción no concuerda con la morfología de la fase de alevín. Nuestro objetivo es describir la anatomía e histología de la aleta caudal del salmón de 15 mm, 30 mm y 60 mm para facilitar el diagnóstico de las patologías tempranas de la aleta caudal. Se trabajó con 60 salmones divididos en tres grupos de 20 en etapas de 15, 30 y 60 mm. Diez salmones de cada grupo fueron procesados con técnicas anatómicas de Hanken & Wassersug . Otros 10 alevines de cada grupo fueron procesados mediante técnicas H&E/azul de Alcian pH 2,5: para glicosaminoglicanos y técnica Histoquímica Picrosirius de Junqueira para colágeno I y III. Al momento de la eclosión de los peces (grupo 1) la aleta caudal no tiene su forma definitiva pero ha iniciado la formación de lepidotriquias. En el grupo 2, la aleta caudal comprende entre 19-20 lepidotriquias y se constituyen dos lóbulos uno dorsal y otro ventral, ambos bajo la notocorda. Los rayos de cada lóbulo crecen más rápido que los rayos que se encuentran entre los lóbulos y se forma un surco entre ellos. En el grupo 3 se observa claramente la aleta bilobulada, se mantienen 19 lepidotriquias que ahora están en proceso de calcificación. Cada lepidotriquia crece distalmente mediante la formación de articulaciones y segmentos. En el grupo 2 se consignó un promedio de 4­5 articulaciones por lepidotriquia y en el grupo 3 han aumentado a 6­10 articulaciones. Esta descripción de la aleta del alevín normal facilita el diagnóstico de la aleta deformada y aporta conocimientos para comparar el desarrollo ontogenético con las fases de la regeneración después de la amputación de la aleta caudal.

Caudal fin pathologies and traumas can affect swimming, impede food and exhaust efficiency, and also increase susceptibility to bacterial and fungal infections. Adult salmon can regenerate their fin quickly and completely if it is amputated. However, yolk sac fry expressing anatomical defects in the caudal fin have been reported in southern Chile and are associated to a high mortality rate where regeneration does not occur. There are many studies on adult salmon but this description does not match the morphology of the juvenile phase. We describe the anatomy and histology of the caudal fin in salmon 15mm, 30 mm and 60 mm to facilitate the early diagnosis of diseases of the caudal fin. We worked with 60 salmon divided into three groups of 20 in steps of 15, 30 and 60 mm. 10 salmon from each group were processed with Hanken & Wassersug anatomical techniques. Another 10 fry from each group were processed using H&E/Alcian blue pH 2.5 techniques: for glycosaminoglycans and technical histochemistry Picrosirius Junqueira for collagen I and III. Upon hatching of fish (group 1) the caudal fin has no definitive form but has commenced training ray or lepidotriquias. In group 2, the caudal fin comprises from 19 to 20 lepidotriquias and two lobes one dorsal and one ventral, both are constituted under the notochord. Each lobe ray grows faster than the rays that lie between the lobes and a groove is formed between them. In group 3clearly shows the bilobed flap, 19 lepidotriquias that are now in the process of calcification are maintained. Each lepidotriquia grows distally by forming joints and segments. In group 2 an average of 4­5 lepidotriquia joints were recorded and in group 3 there was an increase at 6­10 joints. This description of normal fry flap facilitates comparative study of the deformed fin.

Estudio morfológico de la retina de salmones (Salmo salar) / Morphological study of the retina of salmon (Salmo salar)

La retina de peces teleósteos como pez cebra, se ha transformado en un importante modelo para el estudio de la plasticidad neuronal y la neurogénesis. Se ha demostrado además que la retina experimenta cambios ontogenéticos para adaptarse a distintos medios ambientes durante su vida. Este estudio tiene como objetivo describir el desarrollo ontogenético de la retina del alevín de salmón desde la eclosión hasta la fase de juvenil. Se trabajó con 30 salmones divididos en tres grupos de 10. Grupo I: recién eclosionados, con saco vitelino y 18 mm de longitud. Grupo II: sin saco vitelino y 30 mm de longitud. Grupo III: 100 mm de longitud. Cinco alevinesde cada grupo fueron procesados según el protocolo de Hanken & Wassersug para medir los diámetros dorsoventral y nasal-temporal utilizando el cartílago que protege al globo ocular. Los restantes cinco ejemplares fueron seccionados con micrótomo Microm en forma seriada (5 µm) y procesados con técnica H&E/Azul de Alcián. Se midieron las capas de la retina en un microscopio óptico Zeiss, con cámara Powershot incorporada y con un software Image Tool 3.0. El Grupo 1 presentó grandes ojos pigmentados, con aspecto de copa óptica embrionaria, la retina está estratificada en capas. La Capa Nuclear Interna (CNI) mide 62±10 µm y la capa plexiforme interna (CPI) 10±2 µm. El Grupo 2 presenta cambios en el espesor de ellas. La CNI disminuye su espesor a 45±8 µm y la Plexiforme aumenta a 25±5 µm. En los peces juveniles del Grupo 3, la CNI alcanza el espesor mínimo (15±3 µm), por el contrario, la capa Plexiforme interna aumenta su espesor hasta alcanzar (70±10 µm). En los tres grupos estudiados observamos en la periferia de la retina una zona proliferativa germinativa, que corresponde a un remanente del neuroepitelio embrionario, responsable del crecimiento continuado de la retina. La retina de los salmones puede ser también un importante modelo para el estudio de la ontogenia, la plasticidad neuronal y la neurogénesis. Esta neurogénesis en la retina de peces facilita la reordenación celular a lo largo de la ontogenia, lo que potencialmente permite la optimización del sistema visual a los cambios en las demandas visuales. Este estudio puede ser de utilidad para facilitar el diagnóstico en las patologías de ojo en salmonicultura y también puede contribuir a conocer mejor la regeneración de tejidos. Por otro lado, con estudios posteriores, la neurogénesis de la retina de peces podría extrapolarse al tratamiento de enfermedades humanas con daño a nivel retineal, tales como glaucoma, desprendimiento de retina y retinopatía diabética.

The retina of teleost fish zebrafish, has become an important model for studying neuronal plasticity and neurogenesis. It was further shown that the retina undergoes ontogenetic changes to adapt to different environments during their lifetime. This study aims to describe the ontogenetic development of the retina of juvenile salmon from hatching to the juvenile stage. We worked with 30 salmon divided into three groups of 10. Group I: newly hatched with yolk sac and 18 mm in length. Group II: without yolk sac and 30 mm in length. Group III: 100 mm long. Five fry each group were processed according to the protocol of Hanken & Wassersug to measure dorsoventral and nasal-temporal diameters using the cartilage that protects the eyeball. The remaining five specimens were sectioned with a microtome Microm serially (5 µm) and processed with technical H-E / Alcian blue. The layers of the retina were measured on a Zeiss optical microscope with camera Powershot built and with Image Tool 3.0 software. Group 1 showed large pigmented eyes, looking embryonic optic cup, the retina is stratified in layers. The inner nuclear layer (CNI) measured 62±10 microns and the inner plexiform layer (CPI) 10±2 µm. Group 2 presents changes in the thickness of them. The CNI decreases in thickness to 45±8 µm and the plexiform increased to 25±5 µm. In juvenile fish of group 3, the CNI reaches the minimum thickness (15±3 µm), by contrast, the inner plexiform layer thickness increases up to (70±10 µm). In the three groups observed in the periphery of the retina one proliferative germinative zone, which corresponds to a remnant of the embryonic neural epithelium responsible for the continued growth of the retina. The retina of the salmon can also be an important model for the study of ontogeny, neuronal plasticity and neurogenesis. This retinal neurogenesis fish rearrangement facilitates cell along ontogeny, potentially allowing optimization of the visual system to changes in the visual demands. This study may be useful to help diagnose pathologies in eye salmon and can also contribute to better understand tissue regeneration. On the other hand, with later studies, fish's retinal neurogenesis could be extrapolated to the treatment of human retinal diseases, such us glaucoma, retinal detachment o diabetic retinopathy.

Histology of the jaw deformation in salmon of southern Chile (salmo salar)

In adult salmon of the sea centres in southern Chile, a jaw deformation (JD) has been identified. It affects the dental and hyomandibular bones, which bend ventrally up to 90° of their normal position. The deformation affects also the dental articular bone. This pathology is related to weight loss and increased mortality of the salmons. It was empirically postulated that a probable cause for this anomaly was food from vegetal origin in the diet of the fishes (which are carnivores) Therefore, the present work aims at comparing the biostructure of jaw bone of salmons fed either with vegetal (soja and gluten) formulation or animal formulation, mostly fish powder. Fifty specimens were analyzed from Puerto Montt, 35 having JD and 15 normal control. Samples were obtained in June, July and September 1999. (group 1) and March, Sept and October, 2000 (group 2). Group 1 was fed mostly with vegetal flour and group 2 with fish flour. Each group was subdivided in two subgroups, one of healthy animals and the other of fishes with JD. Jaw and articular bones were fixed in 10 per cent formaldehyde and 1 per cent glutaraldehyde and processed for histology (hematoxylin.eosin, Alcian blue, Masson trichrome) histochemistry (Syrius red and von Kossa) and scanning electron microscopy (SEM). The mandibular bone of group 1 with JD presented large amounts of osteoid tissue compared with its control. Collagen I disminishes and its architecture and composition changes, collagen III increases. No significant difference was found in calcium content between normal and JD fishes. SEM shows that the dental bone close to the joint in the fishes with JD displayed a disorganized structure and no trabecular formation, compared to controls, In group 2, these pathological findings were less evident, both macro- and microscopically. Results suggest that JD is of multifactorial origin; the primary cause can be a genetic or congenital alteration of the Jaw cartilage. There should be susceptibility for presentation of the defect in this group of fishes, but its expression is triggered by deficit of phosphorous of animal origin in food, so that this pathology is not seen in fishes with adequate nutrition.